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國立成功大學 環境工程學系 張祖恩、吳哲宏所指導 陳薇羽的 土壤微生物體與生物刺激掩埋反應槽促進多氯戴奧辛污染土壤生物復育 (2014),提出KD Trey 5關鍵因素是什麼,來自於多氯二聯苯戴奧辛、土壤微生物體、生物復育、高通量定序、功能性基因。
而第二篇論文國防醫學院 醫學科學研究所 胡幼圃所指導 李芷葶的 非酒精性肝臟疾病之治療及Cytochrome P450 的變化 (2013),提出因為有 非酒精性肝臟疾病、非酒精性肝炎、細胞色素P450、半乳糖單點法的重點而找出了 KD Trey 5的解答。
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土壤微生物體與生物刺激掩埋反應槽促進多氯戴奧辛污染土壤生物復育
為了解決KD Trey 5 的問題,作者陳薇羽 這樣論述:
含氯戴奧辛同源物有210種同源物,是自然或人為的燃燒程序產生,也是許多工業製程的不純物。因強烈的疏水性與頑固性,不斷地在土壤環境中累積,其中以八氯同源物濃度最高。含氯戴奧辛透過生物鏈濃縮放大效應,會造成嚴重的生態威脅與健康風險的問題。土壤與堆肥中含多樣而特殊微生物菌群,可分解戴奧辛同源物,利用這些關鍵的微生物以及含有的基因與代謝活性,可發展出有效、成本可負擔且對環境友善的生物復育整治方法,減少戴奧辛對環境生態的危害。但是,目前有關降解高氯數戴奧辛同源物的微生物種類、數量、分佈,以及分解戴奧辛的生化代謝機制的瞭解仍然相當有限。本論文主要目的為研究高氯數戴奧辛生物降解的土壤微生物多樣性與
功能,並發展一套污染土壤生物處理系統,提供未來處理污染場址戴奧辛污染之參考方案。 首先,將戴奧辛污染土壤與營養鹽植入血清瓶,進行好氧共代謝降解批次試驗。經過6個星期,土壤中八氯二聯苯呋喃與七氯二聯苯呋喃的濃度由912.7 μmol/kg與88.8 μmol/kg降至0.28 μmol/kg和0.24 μmol/kg,降解速率分別為20.3 μmol/kg/day和2.0 μmol/kg/day,並觀察到脫氯同源物短暫累積。隨後,將批次試驗的泥水轉植至含50 mg八氯二聯苯呋喃粉末的基礎培養基中,培養3個星期後,發現八氯二聯苯呋喃由5,096 μmol/kg減少至913 μmol/kg,去
除率高達82.1%,降解速率為199 μmolkg/day。批次試驗結果指出八氯二聯苯呋喃可生物分解。以選殖分子生物技術分析微生物菌群結構,結果顯示98.3%的微生物菌群屬於Proteobacteria。進一步,配合階層寡核苷酸引子延伸定性定量技術發現,當批次試驗的八氯二聯苯呋喃濃度減少時,Micrococcus、Rhizobium、Pseudoxanthomonas和Brevudimonas菌群相對豐富度顯著地增加。另一方面,利用聚合酵素鏈鎖反應篩選從戴奧辛污染土壤分離具戴奧辛雙氧氧化酵素基因的菌株,且經過21天降解測試,Bacillus sp. B2、Rhodococcus erythro
polis B11、Micrococcus sp. B43、Sphingomonadaceae sp. M2_1及Mesorhizobium sp. M3對八氯二聯苯呋喃的平均降解率為26%-43%,此結果指出污染土壤中存在複雜多樣化具有降解高氯數戴奧辛同源物能力的菌種。 接著,利用次世代高通量定序技術分析戴奧辛污染土壤菌群結構。結果顯示戴奧辛原始污染土壤菌群結構與批次試驗的菌群結構有很大的差異。戴奧辛原始污染土壤以Proteobacteria為主;而批次試驗降解初期,Firmicutes分別佔總菌群的33.6%及80.5%,批次試驗降解末期,豐富度最高的菌群為Proteobacteri
a,佔總菌群的56.7%與41.9%。進一步透過主成份分析結果指出,厭氧菌Sedimentibacter與好氧菌Brevundimonas、Pseudoxanthomonas與Lysobacter分別在八氯二聯苯呋喃降解前後期扮演重要角色。綜合本研究結果推測,雖然有供氧,血清瓶中實際呈現缺氧環境,在好氧性與厭氧性微生物同時存活下,促進八氯二聯苯呋喃脫氯與氧化分解反應。本研究透過次世代高通量定序技術發現污染土壤中微生物多樣性極為豐富,且存在可有效降解戴奧辛的關鍵菌株。 從污染場址分離出的Rhodococcus erythropolis B11對於八氯二聯苯呋喃與其他苯環化合物有不錯的降解能
力。B11 菌株全基因體定序分析結果顯示,獲得的染色體序列為6,838,862 bp,G+C值為62.5%,鑑定到的蛋白質與基因數量分別高達6,332及6,748個。依照蛋白質相鄰同源簇功能類型的註解,代謝相關 (Metabolism) 的蛋白質數量的比例最多,佔總基因體的35.0 %。訊息儲存與處理、細胞程序與信號傳遞相關蛋白質的數量比例分別是12.4 %和9.2 %,而大約有14.0 -29.4%的蛋白質功能是不清楚或尚無法註解。 B11基因體至少含有10種不同環狀化合物的雙加氧酵素,顯示此菌株具有多樣化降解苯環化合物的能力。B11菌株可透過四種途徑 (TreS、OtsA-OtsB、
TreP與TreY-TreZ) 產生生物界面活性劑-海藻糖,環境污染物的增溶能力改變而更容易被利用。除此之外,首次發現Rhodococcus erythropolisB11具有調節與還原汞能力的汞操縱子相關基因-merR與merA。親緣分析顯示汞操縱子可能是經由Janibacter hoylei水平基因轉移至B11。這些功能性基因分析指出此菌株具有運用在環境有機與無機污染物生物復育的潛力。 最後,本研究設計一套掩埋反應槽,添加堆肥後,控制氧化還原電位於缺氧的環境下 (好氧/厭氧條件交替循環),測試實際污染土壤的處理效率。經過280天的操作,R6 (添加10% 污泥堆肥) 與R7 (添加5
% 污泥堆肥和5%牛糞堆肥) 反應槽的戴奧辛總毒性當量去除率分別達53%及79 %,遠高於控制組無堆肥添加的反應槽 (27 %),顯示添加堆肥生物復育程序成功地促進多氯戴奧辛的脫氯與氧化裂環反應。同時,結合高通量定序技術分析掩埋反應槽菌群結構變化,除了數種好氧性的戴奧辛分解菌群,發現戴奧辛毒性當量的降低與厭氧菌群Clostridium菌群豐富度增加有相當高的關聯性,且堆肥添加增加反應槽微生物多樣性,有助於戴奧辛毒性當量穩定地的降低。本研究成功地展示生物強化土壤掩埋反應槽系統處理多氯戴奧辛污染土壤的可行性。這項生物復育技術與操控參數已具實際應用的雛型,可提供未來污染場址如安順廠址整治之參考。
非酒精性肝臟疾病之治療及Cytochrome P450 的變化
為了解決KD Trey 5 的問題,作者李芷葶 這樣論述:
中文摘要非酒精性肝臟疾病(nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD)影響開發國家中3分之1的成人,兒童人口也正在增加中,這是一個正在萌發的健康問題,它的主要特徵是脂肪大量堆積(以triglycerides; TG為主)。病程進展主要是先形成單純性脂肪肝,再引起非酒精性脂性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis; NASH),進而造成肝纖維化甚至是肝硬化等。肝臟病理組織切片仍然是評估肝臟受損後,産生脂肪變性和纖維化發炎症狀的黄金標準,但侵入性所造成的副作用和嚴重取樣差異(sampling variability)使它的應用受限制。
目前没有實驗檢驗值可以正確診斷NAFLD,這個可能原因是具有相同基因的肝細胞,因其所在區域微環境之差異而表現出不同的新陳代謝能力及肝結構的複雜性。過去研究已經集中在生活方式修正和藥物治療,但到目前利用phase III隨機控制試驗,評估藥物控制NAFLD病人病理組織切片和長期藥物使用結果的有效性,仍缺乏有效的結果。到目前為止,没有標準治療規範已被認可。本論文分4部分進行探討:促進 NAFLD的診斷;尋找對抗NAFLD最有效果的治療;探討Cytochrome P450 (CYP)酵素NAFLD變化情形;探討天然純成份及常用藥品賦型劑Hu 25、Hu 33和EPA治療動脈粥狀硬化的效果。第一部份:
促進NAFLD的診斷方法,是利用SD大白鼠產生3組不同嚴重程度NAFLD。正常組是餵食正常飼料;2組實驗組是餵食choline-deficient (CD)飼料,有或没有用silymarin做治療。在4、8和18週,用半乳糖溶液(0.5 g/kg/BW)快速靜脈注射,60分鐘後取内頸動脈血,進一步做生化檢驗和半乳糖分析。移除肝臟是為了做hematoxylin-eosin (H & E)染色和測量肝臟脂質的含量。結果顯示NAFLD肝臟組織切片評分結果的嚴重度和galactose single point method (GSP)、alkaline phosphatase (ALP)、alanin
e-aminotransferase (ALT)、aspartate-aminotransferase (AST)、albumin和total protein(TP)有顯著相關。邏輯斯迴歸(Logistic regression)的結果,GSP和TP是最顯著的預測參數。ALT預測NAFLD經由receiver-operating characteristic曲線,尋找最佳cutoff point後,靈敏度(Sensitivity)和特異性(Specificity)分別是72.4%及52.4%;單獨GSP靈敏度和特異性分別是82.8%及72.4%;然而GSP併用TP靈敏度和特異性分別是82.8%
及81.0%。由研究結果顯示單獨使用GSP或GSP併用TP比起傳统生化檢驗對NAFLD的診斷有最大的靈敏度和特異性。第二部份:尋找最有效的治療藥物。首先成功建立Hep G2 cells用oleic acid誘導形成脂肪細胞的體外篩選模式,尋找有效NAFLD治療藥物。研究方法是根據Harken等人的方法製備,將Oleate/albumin complex加入人類肝細胞(Hep G2)培養24小時,誘發脂肪堆積產生脂肪細胞,再將38種中藥純成份各别培養72小時後,測量Hep G2脂肪細胞中TG的含量。結果顯示在被篩選38種中藥純成份中,在1~5 µM濃度下,發現silymarin、Hu 25、Hu
33和EPA是最有效降低肝細胞內TG堆積。在進入動物實驗驗証治療效果前,Bioflavonoids類藥物不溶於水導致口服bioavailability低,因此需要選擇最佳賦型劑增加藥物血中濃度。依文獻選出常用賦型劑,將bioflavonoids類藥物溶解後,以口服給予SD大白鼠。聚乙烯導管(PE-50) 做右頸動脈插管,以利抽血用。在給藥後0.083, 0.167, 0.33, 0.67, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 and 48小時,以內頸動脈插管方式在各時間點皆取300 μL全血,再以13,000 rpm離心10分鐘獲得血漿。血漿檢品處
理後,利用LC-MSMS分析藥物濃度並選出最佳賦型劑。在被篩選的賦型劑中 Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) E4 M CR有最高藥物血中濃度,經藥動學參數模擬計算以100 mg/kg/day的劑量給藥,藥物藥中濃度可到達5 µM。評估silymarin、Hu 25、Hu 33和EPA治療脂肪肝的效果及CYP酵素治療前後變化情形。利用SD大白鼠餵食CD飼料產生NASH。正常組餵食正常飼料;空白組餵食CD飼料;控制組餵食CD飼料和HPMC E4M CR;治療組餵食CD飼料與各別silymarin、Hu 25、Hu 33和EPA 100 mg/kg/day做治
療。在4和8週後犧牲動物,血液部份進行肝功能評估(GSP、ALT、ALP、total protein)及血脂分析[TG、Total cholesterol (THCO)、Low-density lipoprotein (LDL)、High-density lipoprotein HDL];抗氧化實驗的部份進行superoxide anions、8-iso-PGF2α和malondialdehyde三項分析;肝臟部份進行H & E染色和測量肝臟脂質的含量。研究結果顯示經Hu 25和Hu 33 治療後肝細胞中TG堆積狀況和GSP值比blank和control組顯著降低。在氧化壓力指標,經Hu 25
、Hu 33和EPA治療後血漿中8-iso-PGF2α的濃度皆比blank和control組顯著降低很多。Hu 25和EPA治療後肝臟中O2-.的濃度皆比blank組顯著降低很多。第三部份:CYP酵素變化情形。silymarin治療4週後,CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP4A和UGT2B7的活性比正常組SD大白鼠顯著降低;治療8週後,CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的活性比正常組SD大白鼠顯著升高。Hu 25治療4週後有3個(CYP1A2、CYP2E1和CYP4A)受影響;治療8週後 CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6
、CYP3A4和UGT2B7活性呈現誘導的作用。Hu 33治療4週後有5個受影響,其中CYP1A2、CYP2E1和CYP4A呈現抑制的作用;治療8週後CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7活性呈現誘導的作用。EPA在4和8週治療結果很類似。CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7的活性比正常組SD大白鼠顯著降低;CYP1A2的活性比正常組SD大白鼠顯著升高。我們利用GSP、steatosis、hepatic lipid content等測量值解釋CYP酵素改變的情況。研究方式是利用SD大白鼠產生3組不同嚴重程度的NASH,正常組餵食正常飼料;2組實驗組是餵食CD
飼料,有或沒有用silymarin做治療。在4和8週後,血液檢體測生化檢驗值和半乳糖分析;肝臟做H&E染色和測量脂質含量。結果顯示,在CD和治療組steatosis和inflammation有顯著增加;ALP、ALT、GSP、肝細胞中TG含量 (HTC)在CD組有明顯升高;肝細胞中cholesterol含量(HCC)在CD和治療組都比正常組下降。經逐步多元線性回歸模式分析顯示,併用steatosis和GSP可以預測73.5% UGTB2B7的變異;併用GSP和HCC可以預測51.1% CYP2C9的變異;併用GSP、steatosis和HTC可以預測50.9% CYP1A2的變異;然而併用GS
P和HTC只能預測14.4% CYP2E1的變異;GSP只能預測11.2% CYP2C19的變異。GSP和HTC對CYP2E1及CYP2C19屬於低相關,這可能還包括free radical generation、inflammatory cytokines、interferon等其他因素牽涉其中。第四部份:評估天然純成份及常用藥品賦型劑Hu 25、Hu 33和EPA治療動脈粥狀硬化的效果。利用Syrian hamster餵食high-fat (HF)飼料產生高血脂症。正常組餵食正常飼料;空白組餵食HF飼料;positive control組餵食HF飼料和fluvastatin;治療組餵食HF
飼料與各別Hu 25、Hu 33和3種不同劑量EPA做治療。在12週後犧牲動物,血液部份進行肝功能評估(GSP、ALT、AST和TP)及血脂分析(TG、THCO、LDL、HDL);肝臟部份進行H&E染色。研究結果顯示經Hu 25、Hu 33與不同劑量EPA這5組治療後都能改善高血脂;Hu 33與L-EPA肝功能優於blank與positive control組,這2組有改善脂肪肝和保護肝功能之效果。綜合上述結論,GSP可幫助NAFLD診斷;由體外篩選模式選出天然純成份及常用藥品賦型劑silymarin、Hu 25、Hu 33和EPA是最有效降低肝細胞內TG堆積;Hu 25、Hu 33和EPA除
了可以治療脂肪肝外,對治療動脈粥狀硬化也有效;用GSP值、steatosis評分、肝臟脂質含量等測量值可以預測UGT2B7、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1變異情形。CD飼料餵食4週後,CYP1A2、CYP2C9和UGT2B7活性比正常組顯著降低,CYP2E1活性有顯著升高。8週後CYP1A2和UGT2B7活性比正常組顯著降低。Hu 25治療4週後有3個(CYP1A2、CYP2E1和CYP4A)受影響;治療8週後CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7活性呈現誘導的作用。Hu 33治療4週後有5個受影響,其中CYP1A2、CYP2E1和CY
P4A呈現抑制的作用;治療8週後CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7活性呈現誘導的作用。EPA在4和8週治療結果很類似。CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7的活性比正常組SD大白鼠顯著降低;CYP1A2的活性比正常組SD大白鼠顯著升高。CYP酵素活性容易在長期服用藥物後受影響產生誘導或抑制的作用,因此需要評估CYP酵素活性變化情形,避免藥物交互作用及副作用的產生。
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